雞組織中甲基鹽霉素殘留量的測定實驗

一、實驗部分
1、儀器與試劑
    液相色譜儀，配柱后衍生裝置和二極管陣列檢測器；inertsil ODS3C18液相色譜柱（25 cm×46mm，5μm）；離心機（Sigma公司）；UltraTyrrax T25型勻質器（德國）；硅膠S小柱（500 mg，3mL）。甲基鹽霉素標準品（Sigma 公司）。香草醛（Fluka公司）；衍生液配制：量取5 mL H2SO4，緩慢加入到250mL甲醇中，置冰水浴中緩慢加入20 g香草醛，混勻，脫氣5min后避光保存，臨用現配；異辛烷和甲醇均為色譜純（Fisher公司）；乙酸和濃H2SO4為分析純（北京化學試劑公司）。

2、色譜分離條件
   流動相：V（甲醇）∶V（乙酸）∶V（水）=94∶3∶3；流速： 08 mL/min；衍生液流速：04mL/min；反應溫度： 95 ℃；檢測波長： 520 nm；進樣量： 100 μL；柱溫： 30 ℃。

3、樣品處理
1）樣品中甲基鹽霉素的提取
   稱取組織樣品（50±005）g于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL蒸餾水，以10000r/min以上的速度均質60 s，再加入10 mL異辛烷，旋渦混合3 min左右，以3000 r/min離心5min，吸取上層有機相,備用。然后加入10 mL異辛烷，按上述步驟重復提取一次，取上層有機相,備用，合并兩次離心后的有機相。
2）固相萃取凈化
   用5 mL異辛烷預洗硅膠小柱，不使流干，加入231所得的上清液，然后再用5 mL異辛烷淋洗，過柱流速控制在1~2mL/min，然后抽干小柱，再用2 mL甲醇洗脫，于40℃水浴中氮氣吹干后用10 mLV（甲醇）∶V（水）=90∶10混合液溶解，液相色譜儀測定。

4、線性實驗
   稱取100 mg甲基鹽霉素于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得100mg/L甲基鹽霉素標準儲備液。吸取標準儲備液10 mL于100 mL棕色容量瓶中，得10mg/L標準工作液。將標準工作液用流動相稀釋成70、250、500、1000和5000 μg/L的標準工作溶液和10mg/L標準工作溶液一起進行HPLC分析。每個濃度進樣6次，以標準工作液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

5、添加回收率實驗
   添加回收率實驗添加濃度為20、100、300和600 μg/kg（雞肉），20、100、600和1800μg/kg（雞肝），20、100、300和600 μg/kg（雞腎）及20、100、600和1200μg/kg（雞脂肪）。稱樣后加入標準溶液，渦旋混勻放置05 h后進行樣品處理，其它步驟同23。

二、結果與討論
1、色譜條件的建立
   本實驗色譜條件基本參照文獻[4]進行分析，其中4種組織的添加濃度均為20μg/kg，所得圖譜見圖1。從圖1可知，甲基鹽霉素出峰時間為656 min，峰形較好，在空白組織中未見干擾。

2、提取和凈化條件的選擇
   甲醇、乙睛、丙酮、異辛烷和正已烷可用于提取聚醚類藥物，但為減少后續凈化的壓力，通常選擇極性相對較低的異辛烷、氯仿、乙酸乙酯等。本實驗對異辛烷的提取條件進行了優化，發現當雞肉中添加濃度為5000μg/kg時，提取兩次（每次10mL）直接進樣扣除空白后的回收率>95%。通常，選擇正相固相萃取凈化動物組織中的聚醚類藥物，有氧化鋁小柱和硅膠小柱。本實驗在參考文獻[4]的凈化方法和不影響方法靈敏度的基礎上，將10mL二氯甲烷洗滌液改為5 mL異辛烷，6 mL二氯甲烷/甲醇洗脫液改為2 mL甲醇，節約了溶劑，縮短了實驗時間。

3、衍生化條件的優化
   固定流動相流速，以4種雞組織樣品為基質，考察衍生液的流速對信噪的影響。實驗發現，當衍生液流速為01~04mL/min時，各種組織的添加樣品（濃度100 μg/kg）的信噪比逐步增加；流速為04~08mL/min時，信噪比均無明顯變化。實驗選擇衍生液的流速為04 mL/min。

4、線性實驗
   根據線性實驗方法，在07~100mg/L范圍內，以峰面積對甲基鹽霉素濃度作圖，所得標準曲線方程為y=1058x+105，相關系數均大于09993，說明本方法適用于甲基鹽霉素的定量分析。

5、方法的檢出限、回收率和精密度
   采用在空白樣品中添加標準溶液的方法，對4種雞組織進行了4次添加回收率重復實驗，每次每個濃度點進行5次重復實驗，實驗結果見表1。從表1可見，雞組織中各濃度點平均添加回收率在764%~931%之間。批內相對標準偏差（RSD）在26%~89%之間，批間相對標準偏差（RSD）在47%~97%之間，可見本方法具有較好的準確性和穩定性。甲基鹽霉素在4種雞組織中的檢出限均為60μg/kg （S/N=3），定量限均為200 μg/kg （S/N=10）。表1 雞組織中甲基鹽霉素的平均回收率和相對標準偏差（略）

6、方法應用
   利用本方法對甲基鹽霉素預混劑在雞體內休藥期進行了檢測。休藥0 h,雞肉中含甲基鹽霉素（852±26）μg/kg（n=3）;休藥48 h后,雞肉中未檢出甲基鹽霉素。


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