HPLC法測(cè)定清顆粒中黃芩苷的含量實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?br />    建立液相色譜法測(cè)定一清顆粒中黃芩苷的含量。
方法：采用Hypersill C18（250×4.6mm，5μm）色譜柱，以甲醇－0.2mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.7）（42：58）為流動(dòng)相；流速為1.000mL/ moL，檢測(cè)波長(zhǎng)275nm，柱溫29℃。
結(jié)果：黃芩苷在0.0916～0.7608μg范圍內(nèi)成良好的線性。（r=0.9945），平均回收率98.9%，RSD=0.31%。
結(jié)論：方法簡(jiǎn)便、快速、適用性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。
    一清顆粒是中藥復(fù)方制劑，黃褐色；味微甜、苦。由黃連 ，大黃 ，黃芩共 3味中藥組成，具清熱瀉火解毒，化瘀涼血止血。用于火毒血熱所致的身熱煩躁，目赤口瘡，咽喉、牙齦腫痛，大便秘結(jié)，吐血，咯血，衄血，痔血等癥；咽炎，扁桃體炎。為了更有效的控制制劑質(zhì)量，采用液相色譜法對(duì)該制劑中黃芩苷進(jìn)行了含量測(cè)定，為該制劑的生產(chǎn)提供了質(zhì)量控制依據(jù)。

二、儀器與試藥
    液相色譜儀，Breeze工作站。甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。黃芩苷對(duì)照（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110715-200212），一清顆粒。  

三、方法與結(jié)果
1、色譜條件與適用性試驗(yàn)
   色譜柱：Hypersil  C18（250×4.6mm，5μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm。流動(dòng)相：甲醇－0.2mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.7）（42：58），理論塔板數(shù)按黃芩苷計(jì)算，應(yīng)不低于5000。
2、對(duì)照品溶液制備
   精密稱取在105℃干燥至恒重的黃芩苷對(duì)照品12.5mg，置250ml量瓶中，用少量甲醇溶解，用重蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml中含黃芩苷50μg），即得。
3、供試品溶液的制備
   取本品裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取約0.75g，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇10ml，超聲處理10分鐘，用重蒸餾水稀釋至刻度，取此液離心10分鐘，分取上清液，即得。
4、陰性樣品溶液的制備
   取缺黃芩的模擬制劑約10g按供試品溶液的制備方法依法測(cè)定，結(jié)果表明：陰性樣品的HPLC圖譜中，無(wú)呈現(xiàn)與黃芩苷對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰。
5、測(cè)定法
   分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀測(cè)定含量，以峰面積積分按外標(biāo)法計(jì)算。

四、線性關(guān)系考察
    精密吸取對(duì)照品溶液（濃度為：0.050mg/ml）2、4、6、8、10、12，依次進(jìn)樣，以進(jìn)樣量（μg）對(duì)峰面積進(jìn)行線性分析，方程為Y=100135.548X-117.256，r=0.9945，結(jié)果表明黃芩苷在0.1000-0.6000mg間成良好的線性關(guān)系。
  
五、精密度試驗(yàn)
    精密吸取上述對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μl，測(cè)定峰面積積分值，結(jié)果RSD為0.96%。
　
六、穩(wěn)定性試驗(yàn)
    精密吸取上述對(duì)照品溶液，在0、2、4、6、8小時(shí)進(jìn)樣，共5次，每次10μl，測(cè)定峰面積積分值，結(jié)果RSD為0.80%，表明黃芩苷在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
  
七、重復(fù)性試驗(yàn)
    取同一批號(hào)樣品，按供試品溶液制備方法制備用6個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)（n=6），按正文含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果RSD為 1.21%。
  
八、回收率試驗(yàn)
    取已測(cè)之含量的樣品，平行6份，分別精密加黃芩苷對(duì)照品適量，按供試品制備方法制備和測(cè)定，計(jì)算6次的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2；表2  回收率測(cè)定結(jié)果（略）

九、討論
1、含量測(cè)定中選擇色譜條件時(shí)，曾對(duì)流動(dòng)相包括溶劑系統(tǒng)組成和比例進(jìn)行了研究，，根據(jù)參考文獻(xiàn)對(duì)多種溶劑的選擇：（1）甲醇-水-磷酸（43：57：0.2）；（2）乙腈-水-冰醋酸（50：50：1）；（3）甲醇-水-冰醋酸（50：50：1）；甲醇－0.2mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.7）（42：58），根據(jù)分離情況，選擇甲醇－0.2mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.7）（42：58），流速1ml/min。
2、曾對(duì)樣品的提取方法進(jìn)行考察，分別采用甲醇回流提取1h，甲醇提取0.5小時(shí)、50%甲醇、10%甲醇超聲提取3種提取方法，經(jīng)測(cè)定10%超聲提取的效果好。
3、對(duì)提取工藝研究，以上三味，分別加水煎煮二次，*次1.5小時(shí)，第二次1小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度約為1.25（70℃），噴霧干燥成干浸膏粉；將上述三種浸膏粉加入適量蔗糖與糊精，混勻，制成顆粒，干燥即得，此方法提取效果優(yōu)于以往三藥混合煎煮，而且含量高。

相關(guān)產(chǎn)品信息：Hypersil,Kromasil,廣州氣相色譜儀,色譜標(biāo)準(zhǔn)品,inertsil