液相色譜法測定健骨膠囊中淫羊藿苷的含量實驗

一、摘要
1、目的：建立用液相色譜法測定健骨膠囊中淫羊藿苷含量的方法。
2、方法：LichrospherC18 色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相甲醇-1.5%冰乙酸水溶液（55：45）；檢測波長：270nm；流速1.0ml/min；柱溫30℃。
3、結果：該方法淫羊藿苷回收率為99.28% RSD2.52%。結論：該方法簡便、快速、靈敏度高，可用于該產品的質量控制。 
      健骨膠囊由淫羊藿、補骨脂等藥材組成。用于肝腎不足所致骨質疏松癥。淫羊藿為本方君藥，主要含黃酮、木脂素、生物堿和多糖，淫羊藿苷是淫羊藿中的主要有效物質之一。故選擇淫羊藿苷為指標測定淫羊藿的含量。由于方中藥味較多，其他方法難于測定其含量，故本文采用液相色譜法測定健骨膠囊中淫羊藿苷的含量，該含量測定方法是在文獻基礎上結合本制劑的特點進行方法學考察而確立的。
  
二、儀器與試藥
    戴安液相色譜儀，UVD340U二極管陣列檢測器，ASI-100自動進樣器，戴安色譜工作站，色譜柱：LichrospherC18 柱（5μm，150mm×4.6mm）；甲醇為色譜純，水為重蒸水。淫羊藿苷對照品（批號111640-200401）由中國藥品生物制品檢定所提供。健骨膠囊，淫羊藿陰性膠囊由哈爾濱商業大學制劑室自制。
  
三、方法與結果

1、色譜條件
   色譜柱：LichrospherC18 柱（5μm，150mm×4.6mm）；流動相：甲醇-1.5%冰乙酸水溶液（55：45）；檢測波長：270nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃。分離度（R）：大于1.5；色譜柱的理論塔板數按淫羊藿苷峰計算應不低于2500。
2、對照品溶液的制備
   精密稱取經干燥至恒重的淫羊藿苷對照品，加甲醇溶解制成1.31mg/ml的對照品溶液。精密吸取對照品溶液5μl，注入液相色譜儀。
3、供試品溶液的制備
   取干燥至恒重的健骨膠囊內容物1g，研細，置于具塞錐形瓶中，精密稱定，精密加入甲醇20ml，密塞，稱定重量，超聲處理1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過。取續濾液，即得。精密吸取供試品溶液5μl，注入液相色譜儀。   
4、陰性供試液的考察
   取淫羊藿陰性膠囊內容物1g，研細，置于具塞錐形瓶中，精密稱定，按2.3供試品溶液的制備項下方法操作。陰性樣品在與對照品和供試品相對應的位置上無吸收峰。結果表明陰性供試液對樣品溶液的測試無干擾。該法的專屬性良好。
5、檢測波長的選擇
   取淫羊藿苷對照品溶液（3.64μg/ml），在230～500nm處進行掃描，結果在269.8nm波長處有zui大吸收，選定270nm做測定波長。
6、線性范圍
   精密稱取淫羊藿苷對照品13.1mg，置10ml容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。制成1.31mg/ml淫羊藿苷甲醇溶液。精密量取以上對照品溶液：0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml分別置于2ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，質量濃度分別為0.262、0.524、0.786、1.048、1.310mg/ml的對照品溶液。各精密量取5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積。以峰面積值（A）對濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程，A=168.523C-2.982 r=0.9996，并以峰面積值A對濃度C作圖，得一直線。以上結果表明，在0.262mg/ml～1.310mg/ml范圍內，進樣濃度與峰面積值有良好的線性關系。
7、精密度實驗
   精密量取淫羊藿苷對照品溶液（1.31mg/ml）20μl注入液相色譜儀，重復進樣6次，記錄色譜圖，計算相對標準偏差，試驗表明：該法的精密度良好。
8、穩定性實驗
   精密吸取同一供試品（批號050407）溶液，分別于0、2、4、6、8、12小時進樣，依法測定，結果表明，供試品溶液在12小時內穩定。
9、 重現性實驗
    按3供試品溶液的制備方法，對同一批樣品（批號050407）6份進行測定，求得相對標準偏差RSD=0.50%。　
10、加樣回收率實驗
    分別取六份健骨膠囊內容物各0.5g，研細，置于具塞錐形瓶中，精密稱定，分別加入一定濃度的淫羊藿苷對照品溶液，水浴蒸干，精密加入甲醇20ml，密塞，稱定重量，超聲處理1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。各精密量取5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果表明，該法的準確度較好。
11、檢測限和定量限的測定
    為保證含量測定的準確，須確定供試品中被測物能被檢測出的zui低量和被定量測定的zui低量。采用信躁比法，當淫羊藿苷濃度為26.2μg/ml時，信躁比為3∶1，則淫羊藿苷的檢測限為26.2μg/ml；當淫羊藿苷濃度為39.3μg/ml時，信躁比為10∶1，則淫羊藿苷的定量限為39.3μg/ml。
12、耐用性試驗
    考察流動相比例、流速的變動，對分離度等結果的影響。
    結論：在測定條件下，系統的輕微變動對試驗結果影響不大，系統耐用性良好。
13、含量測定
    取健骨膠囊內容物1g，研細，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，稱定重量，超聲處理1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液10ml，并轉移至10ml量瓶中，即得。另取淫羊藿苷對照品，用甲醇制成每1ml中含淫羊藿苷1.31mg的溶液，作為對照品溶液。取供試品溶液與對照品溶液各5μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，測定結果表明10批次的制劑質量穩定。

四、討論
    分別選用不同提取溶劑甲醇、氯仿、乙酸乙酯對健骨膠囊進行提取，測定。結果差別明顯，氯仿、乙酸乙酯的提取量較低，用甲醇提取比較*。通過對供試液制備中提取時間的考察，結果顯示提取時間為60、80分鐘時，淫羊藿含量zui高，且無明顯差異，提取40分鐘淫羊藿苷含量較低，提取不充分，zui終確定提取時間為60分鐘。
    該方法簡便、快速、靈敏度高，可用于該產品的質量控制。

相關產品資料：Hypersil,Kromasil,廣州氣相色譜儀,色譜標準品,inertsil