液相二極管陣列檢測法測定芫花藥材指紋圖譜

摘要】目的建立芫花藥材的液相指紋圖譜分析方法。方法采用依利特Hypersil ODS2色譜柱（4.6mm×250mm,5μm），甲醇水梯度洗脫，體積流量為1ml/min，柱溫35℃，檢測波長332nm，記錄時間50min。以芫花素為參照物，對17批樣品進行測定并計算相似度。結果初步建立芫花藥材的指紋圖譜，標定7個共有峰，各產地藥材之間的相似性良好。結論該方法穩定可靠，簡單可行，能夠提高芫花藥材的質量控制標準。

　　【關鍵詞】芫花藥材反相液相指紋圖譜相似度

　　芫花為瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.etZucc.的干燥花蕾，為傳統的瀉下逐水藥，有毒，具有瀉水逐飲、解毒殺蟲的功效，內服用于治療水腫脹滿，胸腹積水，痰飲積聚，氣逆咳喘，二便不利，外用治療疥癬禿瘡，凍瘡。現代研究表明芫花還具有治療慢性支氣管炎、肝炎、妊娠中期引產、抗白血病等作用。

　　芫花中的黃酮類成分（芫花素等）為其鎮咳祛痰、殺蟲的有效成分；二萜原酸酯類成分（芫花酯甲等）是利水、殺蟲的有效成分，也是毒性成分。兩種成分含量測定方法及含量限度要求已另文發表。作為多組分的中藥材，僅有某個有效成分或毒性成分的定性定量研究不足以全面反映芫花藥材質量。指紋圖譜在控制多組分成分方面具有整體性和特征性的優點。目前尚未見到芫花藥材指紋圖譜研究的文獻報道。因此本實驗采用HPLCDAD法對其進行研究，以芫花素為參照物，測定17批樣品并計算相似度，標定了7個共有峰，初步確定了芫花藥材的指紋圖譜，以期為提高該藥材的全面質量控制建立一種快速、簡單、準確有效的方法。

　　1、儀器與試藥

　　依利特P1201液相色譜儀，依利特DAD230+二級陣列檢測器。

　　芫花素對照品為自制，經UV，1HNMR，13CNMR鑒定結構，經HPLC檢測，面積歸一化法計算純度大于98%，符合含量測定的要求。甲醇為色譜純，水為自制高純水，其余試劑均為分析純。

　　芫花藥材共17批，其中市售品15批，分別購自河北安國（3批）、安徽亳州（2批）、廣西（4批）、河南鄭州（2批），河南登封（3批）、廣州清平（1批）；采集品2批，采自河南信陽；經原思通研究員鑒定均來源于瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.etZucc.的干燥花蕾或花。

　　2、方法與結果

　　2.1色譜條件色譜柱為DiamonsilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）。流動相為甲醇、水，兩相梯度洗脫，0min，45％甲醇；10min，55％甲醇；20min，65％甲醇；40min，80％甲醇；50min，100％甲醇沖柱30min，然后用45％甲醇平衡柱子30min。體積流量為1ml/min。柱溫為35℃。檢測波長332nm。記錄50min的色譜圖。

　　2.2對照品溶液的制備取芫花素對照品約0.5mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，每毫升中含芫花素0.0216μg/μl。

　　2.3供試品溶液的制備取各地樣品0.5g，精密稱重，準確加入甲醇25ml，稱重，超聲10min，待其冷卻至室溫，稱重，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液過微孔濾膜（0.45μm），即得。

　　2.4樣品測定精密吸取各樣品的供試品溶液10μl和對照品溶液5μl，注入液相色譜儀，記錄液相色譜圖。

　　2.5方法學考察

　　2.5.1精密度實驗取供試品溶液（第6號樣品），連續進樣5次，測定，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3％，表明儀器性能良好。

　　2.5.2重復性實驗取第6號樣品5份，制備供試品溶液，分別進樣測定，計算得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3％，表明樣品的制備方法穩定。

　　2.5.3穩定性實驗取第6號樣品5份，分別在0，2，4，6，8，12h進樣，測定，計算得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3％，表明樣品溶液在12h內穩定性較好。

　　2.6指紋圖譜及技術參數［5］在上述條件下測定17批樣品，選擇各樣品中共有的7個色譜峰作為共有峰。以芫花素色譜峰（7，S）為參照峰，其保留時間和峰面積為1，分別求出其他各組份的相對保留時間和相對峰面積，結果見表1～2。表117批芫花藥材指紋圖譜中共有峰的相對保留時間表217批芫花藥材各批樣品中各共有峰的相對面積

　　2.7相似度評價及對照指紋圖譜的建立采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2000A版）》對各樣品色譜圖的原始數據文件（輸出格式為aia）進行分析，自動匹配，并以17批樣品生成的對照譜圖（中位數法）作為對照模板，得到芫花對照藥材的對照指紋圖譜；計算各色譜圖的整體相似度均在0.9以上。

　　3、討論

　　3.1流動相的確定為獲取足以代表芫花特征的指紋圖譜，在選擇HPLC色譜條件的過程中，曾以甲醇水系統和乙腈水系統為流動相，分別進行考察，結果顯示甲醇水系統所得色譜圖基線平穩，主要色譜峰均基本達到基線分離，因此確定以甲醇水系統為流動相。

　　3.2檢測波長和采集時間的選擇為了獲得更多的樣品信息，采用光電二極管陣列檢測器（DAD）全波長掃描的方法，采集不同波長下的色譜圖，以332nm下基線平穩，且色譜峰數目較多，各峰的分離度較好，峰高合適，因此確定332nm為檢測波長。實驗中記錄了110min的色譜圖，發現50min以后無色譜峰出現，故確定采集時間為50min。表317批芫花藥材指紋圖譜相似度結果

　　3.3提取溶劑的選擇采用多種提取溶劑，如三氯甲烷、乙醇、甲醇作為溶劑進行提取，研究中發現，而三氯甲烷和乙醇中色譜峰數目較少，且芫花素峰面積較小，說明這兩種試劑對該藥材中成分的提取效果較差；而甲醇提取液中色譜峰較多，且分離度較好，因此選擇甲醇為提取溶劑。

　　3.4小結本實驗以HPLCDAD法測定芫花藥材的指紋圖譜，方法簡便，可操作性強，對于提高該藥材的質控標準提供了實驗數據。所建立的芫花藥材HPLC對照指紋圖譜可以作為芫花藥材真偽鑒別的參考依據。如果能夠獲得更多代表性的樣品，按照不同產地、不同采收期分別進行測定，比較異同點；或者在樣品制備過程中采用現代方法（如大孔樹脂法等），獲得更多成分的信息，將會獲得更全面的科學依據。芫花藥材主要包括黃酮類成分和二萜原酸酯類成分，兩類成分極性和含量差異較為懸殊，很難在同一色譜圖上顯現各自的成分群。本實驗方法主要對芫花藥材中的黃酮類成分進行測定，對二萜原酸酯類成分群的指紋圖譜研究將需做進一步的研究，使芫花藥材的質量評價體系更為完善。